Principy izolace DNA vycházejí z chemických vlastností deoxyribonukleové kyseliny:

1. Fosfátové estery jsou silné kyseliny a chovají se jako anionty při neutrálním pH
2. DNA se snadno precipituje alkoholem
3. Base jsou jen slabě basické a bez náboje
4. Vodíkové vazby mezi skupinami -NH2 a -OH jsou stabilní od pH 4 do pH 9
5. Nukleové kyseliny mají maximum absorpce UV světla při 260 nm, jednovláknová DNA dává o 20 - 30% větší absorbanci než dvouvláknová
6. DNA je mimořádně stabilní molekula a zaujímá obvykle konformace A, B, C nebo Z.

K extrakci a purifikaci DNA z leukocytů (0.5 20 ml plné krve s 5 mmol/l K2 -EDTA), amniových buněk a choriových klků se používá směs chloroform-fenol s proteinasou K, guanidinhydrochlorid s proteinasou K, chloroform s chloristanem sodným v silikonové suspenzi a mnoho dalších. Odběr choriových klků se považuje za bezpečný od 10. týdne gravidity dále (časnější odběry nesou riziko amputací končetin plodu).

Pro rutinní praxi klinické laboratoře (pro univerzální potřeby analytické a pro archivní potřeby uchovávání vzorků v DNA bance) je vhodnou metodou k izolaci DNA metoda s guanidinhydrochloridem (Sambrook et al., 1989; Shibata et al., 1994). Pro účely polymerázové řetězové reakce je možno použít následující alternativní zdroje DNA pro její extrakci:

a) izolace DNA z krevního odběru na novorozenecký screening fenylketonurie
b) izolace DNA ze vzorku buněk bukální sliznice získaných výplachem úst
c) izolace DNA z buněk vlasových kořínků.

Vzorky žilní krve odebrané do zkumavek s K2 -EDTA uzavřeného systému by měly být zmraženy nejpozději do 3 hodin po odběru a skladovány při teplotě -70 °C.

Metoda izolace DNA s guanidinhydrochloridem je založena na následujícím postupu (Průša et al., 1996): hemolýza vodou, centrifugace k získání11 leukocytů, cytolýza pomocí detergentu, centrifugace k získání jader, homogenizace peletu s guanidinhydrochloridem vychlazeným na 4 až 6 °C a s octanem amonným na třepačce, lýza jader pomocí dodecylsulfátu sodného a deproteinace proteinasou K, inkubace při 37 °C nebo 57 °C, precipitace ethanolem, solubilizace v 1 ml TE pufru, reprecipitace, kontrola koncentrace a čistoty. Iminomočovinové (guanidinové) soli jsou velmi silné chaotropní látky a působí jako denaturační činidla mimořádně účinně (Zolfaghari et al., 1993). Chemicky se jedná o aminomethanamidinhydrochlorid, o relativní molekulové hmotnosti 95.53, [HN=C=(NH2).HCl].

Izolace RNA se provádí ultracentrifugací v prostředí CsCl po destrukci buněčných membrán guanidinthiokyanátem. RNA vytvoří pelet, DNA a proteiny zůstanou nad vrstvou CsCl. Jinou metodou je extrakce guanidinthiokyanátem s fenolem v prostředí nízkého pH. Existuje řada komerčních kitů, některé jsou založeny na využití polyadeninového řetězce mRNA. Etanolový precipitát RNA se uchovává při -20 °C, vodný roztok při -70 °C. Izolovaná neporušená celková RNA dává při kontrole elektroforetickou separací v agarosovém gelu dva pruhy: 28S rRNA a 18S rRNA.

Měření koncentrace a čistoty získaného vzorku DNA a RNA.

V běžné praxi se používají dvě metody. Jestliže je vzorek čistý, tj. neobsahuje významné množství nečistot jako jsou bílkoviny, fenol, agarosa, pak spektrofotometrické měření v UV světle je jednoduché a přesné. Jestliže je množství DNA nebo RNA velmi malé (<25 mg/l) nebo vzorek obsahuje významné množství nečistot, pak koncentrace nukleových kyselin může být zjištěna z intenzity fluorescence emitované ethidiumbromidem srovnáním se vzestupnou řadou standardních vzorků DNA o koncentraci od 0,5 - 50 mg/l. Touto metodou je možno zjistit tak malé množství jako je 1 - 5 ng DNA. Při spektrofotometrickém měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou. Měří se při vlnových délkách 260 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty vzorku, očekávané poměry jsou 1.8 pro DNA a 2.0 pro RNA. Poměr absorbancí 260/280 menší než 1,75 svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin. V případě vyššího obsahu nečistot se provede reprecipitace vzorku.

Optická hustota 1 odpovídá přibližně 50 mg/l pro ds-DNA, 40 mg/l pro ss-DNA a RNA, 20 mg/l pro oligonukleotidy. Dále by měla následovat kontrola celistvosti získané DNA elektroforézou a fotografií gelu na UV transiluminátoru (0,8% agaróza, 100 V, asi 1 hodinu) po obarvení ethidiumbromidem. Výtěžek DNA z 5 ml krve činí obvykle 150 600 mg/l. K automatizaci provozu klinické molekulárně genetické laboratoře byly vyvinuty komerční kity pro izolaci DNA (RNA) a jednoduché UV spektrofotometry pro kvantifikaci oligonukleotidů, RNA a DNA s automatickou kalkulací. Od roku 1987 je možno provádět izolaci DNA pomocí automatického extraktoru nukleových kyselin. Jsou to například přístroje jedné americké firmy, jejichž automaty používají metodu chloroform-fenolové extrakce s proteinasou K.