Co jsem se ve škole neučili . . .

Cytometrická DNA analýza u nádorů dětského věku
Teze přednášky k habilitačnímu řízení (Zasedání vědecké rady 2. LF UK dne 19. 6. 1997) MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.(klinika dětské onkologie 2. LF UK)

Obsah DNA v jednotlivých buňkách přináší dva parametry významné v diagnostice a zvláště prognostice zhoubných nádorů:

1/ DNA ploidii: ta udává kolikrát obsahují nádorové buňky více DNA než normální diploidní buňky. Vyjadřuje se jako tzv. DNA index (DI), což je poměr obsahu DNA v G0/G1 fázi sledovaných buněk ku obsahu DNA v G0/G1 fázi normální diploidní populace.

2/ Parametry kinetiky buněčné populace udávané jako procento jednotlivých fází buněčného cyklu. Průtokovou cytometrií rozlišujeme podle obsahu DNA tři fáze: G0/G1, S a G2/M fázi.

Většina autorů udává souhlas cytometrické DNA analýzy a cytogenetického vyšetření nejméně v osmdesáti procentech. U rozdílných nálezů je zpravidla nalezena DNA aneuploidie (změněný obsah DNA) při normálním počtu chromozómů. Tento rozdíl je dán tím, že získané mitózy mohou pocházet pouze z nenádorových buněk. Rozhodně však cytometrická DNA analýza nemůže nahradit cytogenetické vyšetření. Cytometrické vyšetření sice velmi rychle, přesně, spolehlivě a levně informuje o celkovém obsahu DNA v buňce, ale neprokazuje chormozomální aberace, které nemění celkový obsah DNA. Ideálním řešením je tedy kombinace obou vyšetření.

Nález aneuploidní populace může v některých situacích znamenat průkaz nádorových buněk. U benigních nádorů a nenádorových onemocnění je aneuploidie vzácná. Sami jsme nikdy nezachytili DNA aneuploidii u benigního nádoru. Prokázali jsme však malou aneuploidní populaci v krvi dvou pacientů v časné fázi infekční mononukleozy vyšetřených pro podezření na leukémii. Tento dousud nikým nepublikovaný nález si vysvětlujeme buď přítomností virové dvouvláknové DNA nebo zástavou syntézy DNA v infikovaných B lymfocytech.

Nejčastěji jsme nalézali DNA aneuploidii u neuroblastomu, Ewingova sarkomu a periferního neuroektodermového nádoru, sarkomů měkkých tkání, nefroblastomu a mozkových nádorů. Při hledání prognostického významu DNA ploidie u solidních nádorů jsme nalezli kromě neuroblastomu pouze méně významný vztah DNA aneuplodie u sarkomů měkkých tkání. U žádného pacienta s blastémovým typem nefroblastomu jsme nenalezli aneuploidii. Jiné vztahy vzhledem k prognóze, formě průběhu či histologickému typu jsme nenalezli. Protože DNA ploidie je jedním z faktorů, podle kterého je neuroblastom tříděn do prognostických podskupin, zaměřili jsme naší první retrospektivně-prospektivní studii na studium DNA analýzy u neuroblastomu. Vzhledem k tomu, že se v průběhu chemoterapie DNA ploidie může měnit, zabývali jsme se vztahem obsahu buněčné DNA k ostatním prognostickým faktorům i k prognóze pouze tam, kde byly k dispozici vzorky odebrané před zahájením chemoterapie.

V našem souboru 76 pacientů s neuroblastomem jsme prokázali vztah DNA ploidie k ostatním ostatním prognostickým faktorům. Se stoupajícím věkem, který je u neuroblastomu nepříznivým prognostickým faktorem, klesal výskyt aneuploidie. U klinického stádia 1, 2 a 4S byl výskyt aneuploidie častější než u 3. a 4. klinického stadia. Významně častější byl výskyt DNA diploidie u nádorů, které měly amplifikován onkogen N-myc nebo deletováno krátké raménko 1.chromozomu. Častěji jsme nalezli aneuploidii mezi skupinou dětí, které byly v kompletní remisi, než ve skupině těch, které zemřely nebo žily s progredující chorobou. Prognosticky významným údajem u některých nádorů je i změna DNA ploidie v průběhu onkologické léčby. U několika pacientů léčených pro neuroblastom, který v průběhu léčby vyzrával, se objevilo zmnožení obsahu DNA u původně DNA diploidních nádorů. U jiných dětí se naopak obsah DNA změnil na diploidní se vzrůstající anaplázií neuroblastomu. U chlapce s opakovaně recidivujícím rabdomyosarkomem, pro který zemřel, jsme pozorovali vznik aneuploidie se vzrůstajícícm DNA indexem u každé recidivy.

Při ověřování použitelnosti DNA analýzy k průkazu malého množství nádorových buněk jsme prováděli diluční pokusy. Citlivost se výrazně mění s DNA indexem, tedy poměrem obsahu DNA v aneuploidních a diploidních buňkách, za optimálních podmínek lze prokázat 1 nádorovou buňku na 200 normálních.

Závěrem lze shrnout, že u neuroblastomu jsme potvrdili prognostický význam DNA analýzy, čehož využíváme při výběru terapeutického postupu. Prokázali jsme vysokou citlivost metody a její využití při detekci minimální zbytkové choroby.