Bpttt.gif (7078 bytes)

PTT je moderní metoda (popsána poprvé v roce 1993) k detekci mutací, které vedou ke vzniku předčasného stop kodonu a tím k předčasnému ukončení translace. Od ostaních metod se liší tím, že detekce mutací se provádí na úrovni proteinů. Metoda umožňuje analýzu relativně velkých fragmentů genů (2 - 3 kb) a detekuje výlučně patologické mutace, které vedou k neúplným bílkovinám, přičemž ignoruje např. polymorfismy. Některá onemocnění jsou způsobena v 86 - 98 % mutacemi, které vedou výlučně ke zkrácenému produktu translace (např. gen pro dystrofin, tumor supresorové geny BRCA1 a HNPCC). Obvyklé provedení tohoto testu spočívá nejprve v amplifikaci příslušné části genomické DNA (případně mRNA) pomocí PCR (případně RT-PCR), přičemž jeden primer obsahuje startovací ATG kodon, T7 promotor a Kozakovu sekvenci. Následuje transkripce PCR produktu do RNA pomocí T7 RNA polymerasy a potom konečně translace např. pomocí lyzátu retikulocytů. Zkrácené proteiny jsou separovány elektroforeticky v SDS polyakrylamidovém gelu podle své molekulové hmotnosti a detekovány např. barvením stříbrem. Jiné snadné a citlivé detekce se docílí, když se při translaci použijí tRNA, které nesou lysin značený biotinem. Po SDS-PAGE produktů translace označených biotinem se provede western blotting na membránu např. z nitrátu celulosy. Použitím systému strepravidin-peroxidasa a luminol-jodophenol se chemiluminiscence detekuje expozicí na film. Kompletní PTT test z produktu PCR trvá přibližně 6 hodin. Místo T7 promotoru se někdy používá promotoru SP6 nebo T3 a příslušné fágové RNA polymerasy.

Internetové odkazy
http://www.promega.com/expression/exrefr.html