Bsekn.gif (7036 bytes)

Určení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNAo několika stech bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovy metody (dideo-xynukleotidová, ddNTP reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenování na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid. Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA, označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze syntézou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynukleotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů. Sekvenační 5% polyakrylamidový gel je denaturační (např. 7 mol/l urea), obvykle 0.3 mm silný, separační vzdálenost 50 cm, TBE pufr. Parametry zdroje pro separační rychlost asi 100 bazí za hodinu jsou 60 W (1900 V, 45 mA). Moderní sekvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení terminátorů reakce (ddNTP), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, optimální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specializovaný software.

PC25_A.gif (390409 bytes)xxxx
xx
x
xx