Bmeto.gif (4458 bytes)

Po označení nukleových kyselin následuje fáze detekce a případně kvantifikace. Značení DNA se provádí metodami enzymatickými nebo přímou chemickou vazbou. V obou skupinách rozlišujeme značení radioaktivní a značení neizotopové. Enzymatické metody umožňují značení homogenní nebo značení pouze 3’ nebo 5’ konců.

K radioaktivní detekci se používají nukleotidy značené těmito izotopy:

Radioizotop

32P

35S 3H 14C 131I
Typ záření ß ß ß ß ß , gamma
Poločas 14.3 dnů 87.4 dnů 12.26 roků 5730 roků 8,04 dnů
ß energie (MeV) 1,709 0,167 0,019 0,156 0,806

Neizotopové enzymatické systémy značení dosahují stejné citlivosti jako radioaktivní a jsou vhodné pro automatizaci. Nejpoužívanější systémy detekce jsou např.:

a) biotin - protilátka - enzym - substrát
b) biotin - streptavidin - enzym - substrát
c) sulfonová skupina - protilátka - enzym - substrát
d) digoxigenin - protilátka - enzym - substrát
e) fluorescenční detekční systém (např. rhodamin).

Ve všech těchto systémech se používá některý z chromogenních, chemiluminiscenčních nebo fluorescenčních substrátů a enzym je konjugován s protilátkou nebo s avidinem. Používají se alkalická fosfatasa, peroxidasa, glukosidasa, beta-galaktosidasa.

Velmi citlivý způsob detekce je bionylace nukleových kyselin a následná specifická reakce s modifikovaným avidinem (konstanta afinity K = 10 -15 mol). Bionylace se provádí arylazidovým derivátem biotinu s následnou fotoaktivací. Vzniká vysoce reaktivní skupina, která umožní kovalentní vazbu biotinu s nukleovou kyselinou. Hybridizace in situ vyžaduje někdy navíc inaktivaci endogenního biotinu (např. v hepatocytech).

Také některé metody přímého značení založené na fyzikálních a chemických principech vazby s nukleovou kyselinou jsou hojně používány. Mezi tyto systémy patří značení ethidiumbromidem, radioaktivním jodem nebo barvení stříbrem. Možná je také kovalentní vazba enzymů na nukleovou kyselinu. Příkladem je zesílený chemiluminiscenční detekční systém. DNA se značí přímo peroxidasou, která působí za přítomnosti H2O2 na luminol, zesílení signálu se provádí pomocí derivátů fenolu (například 4-iodofenol). Emitované světlo se detekuje na fotografickém filmu nebo se měří na luminometru.

Řada detekčních systémů umožňuje různé sestavy a ve spojení s amplifikační reakcí jsou tyto metody vhodné pro automatizaci.

Porovnání vybraných metod vhodných pro detekci neznámé mutace:

Metoda

Velikost produktu

Senzitivita metody Lokalizace mutace
SSCP 250 bp 80 % ne
DGGE 600 bp 95 % ne
CMC 1700 bp > 95 % ano
Přímé sekvenování 500 bp > 99% ano
Heteroduplexy 300 bp 80 % ne