Bampl.gif (5243 bytes)

1) Polymerázová řetězová reakce (PCR)

PCR byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii. Jedná se o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Saiki et al., 1988; Schutzbank et al., 1993; White et al., 1992). Dvouvláknová DNA je nejprve denaturována na dvě jednovláknové templátové (matricové) molekuly DNA. Nukleotidová sekvence cílové DNA nemusí být známa, ale musí být známé alespoň sekvence krátkých úseků na obou koncích cílové amplifikované DNA. Oligonukleotidové sondy (primery), které hybridizují na obou stranách cílové DNA, řídí syntézu nových vláken. Jejich syntézu katalyzuje termostabilní DNA polymeráza (například Taq z bakterie Thermus aquaticus) od 5’ konce ke 3’ konci vždy začínající od primerů. Během prvního cyklu syntéza nového vlákna pokračuje dále až za sledovanou sekvenci, ale následné cykly již amplifikují převážně pouze úsek mezi dvěma vybranými sondami (primery). Některé termostabilní DNA polymerasy (případně jejich kombinace v reakci) umožňují amplifikaci fragmentů až 5000 bp, jiné uměle upravené se aktivují až při působení teploty 95 °C po dobu 10 minut.

Přehled termostabilních DNA polymeras a jejich charakteristika podle exonukleasové aktivity:

Polymerasa

5´-> 3´ exonukleasa

3´-> 5´exonukleasa

Taq

ano

ne

Tfl

ano

ne

Tbr

ano

ne

Tth

ano

ne

Stoffelův fragment

ne

ne

Tli

ne

ano

Pfu

ne

ano

Pwo

ne

ano

UI Tma

ne

ano

Reakční podmínky:

Teplotní fáze reakčního cyklu:

a) denaturace optimálně při 95 °C, toleranční rozpětí 92 - 98 °C, pro fragmenty do 1 kb 15 sekund, pro větší fragmenty 0.5 - 1.0 minutu,
b) hybridizace optimálně podle denaturační teploty duplexu templátové DNA s primerem minus 12, obvykle mezi 50°C a 55°C, nízká teplota podstatně snižuje specifitu, vysoká teplota zamezí amplifikaci,
c) syntéza obvykle mezi 70°C a 74°C, pro fragmenty do 1 kb 0.5 - 1.021 minuta, pro úseky 6 - 10 kb je potřebná doba až 15 minut, pro primery bohaté na obsah GC je někdy vhodná teplota 80°C.

Počet cyklů se obvykle pohybuje v rozmezí 15 - 30. Každá reakce s testovaným vzorkem musí mít positivní kontrolu, slepou (negativní kontrolu) a interní kontrolu probíhající amplifikace.

Významnou inhibici PCR způsobují erytrocyty (například primárně hemolyzovaná krev). Takový vzorek vyžaduje odstranění inhibitorů nebo jejich neutralizaci. Jednoduchá metoda je založena na využití iontoměničové pryskyřice (např. kopolymer styren-divinylbenzenu) Chelex 100, která váže dvojmocné ionty (Miffin et al., 1994; Shibata et al., 1994).

Princip polymerázové řetězové reakce (tři fáze 1. cyklu)

xx

Zkušenosti s PCR poukázaly na nutnost zavedení technik, které minimalizují kontaminaci amplikonem (produktem PCR). V praxi je běžné používat negativní kontrolu a slepou (reakční směs bez cílové DNA). Jedna preventivní metoda k zabránění kontaminace je založena na využití dUTP místo dTTP v reakční směsi PCR. Bakteriální enzym uracil-N-glykosylasa degraduje DNA obsahující uracil. Jenom fragmenty DNA pocházející z PCR budou degradovány, protože normální DNA uracil neobsahuje. Uracil-Nglykosylasa je přidána do reakční směsi před zahájením amplifikační reakce, aby všechny případné amplikony byly včas degradovány. Samotný enzym je pak inaktivován při prvním denaturačním cyklu, takže nové produkty PCR se již mohou akumulovat v reakční směsi. Jiná metoda je založena na přidání derivátu psoralenu do směsi na začátku reakce. Psoralen neinterferuje s amplifikací a je stabilní během teplotních cyklů. Zkumavky jsou po ukončení reakce ještě před otevřením vystaveny UV světlu. Interakce mezi formami isopsoralenu a pyrimidiny neovlivňuje hybridizaci, ale zabraňuje následné amplifikaci DNA polymerasou. Další běžnou metodou je používání speciálních pipet a pipetovacích špiček s filtrem.

 ss

s

Rozsáhlé diagnostické využití repetitivních sekvencí DNA je umožněno aplikacemi PCR metod, např. AFLP (délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů). Repetitivní sekvence jsou označované podle svých specifik jako VNTR (variable number of tandem repeats), STR (short tandem repeats), (CA)n , mikrosatelity (Epplen, 1992). V lidském genomu je přibližně 50000 - 100000 (dC-dA)n .(dG-dT)n . Jedná se o podskupinu STR, běžně označovanou (CA)n . Využívají se např. v diagnostice příbuzenských vztahů, delecí genů nebo ztráty heterozygocie.

„Nested“ PCR. Amplifikuje se nejprve úsek, kde templátem je genomická DNA. Následuje další PCR zv. „nested“ reakce, kde templátem je produkt reakce předcházející. Pro první reakci se použije první sada oligonukleotidů, v druhé, „nested“ reakci se použijí oligonukleotidy, které jsou navrženy pro fragment získaný jako produkt první PCR. Tato oblíbená modifikace má řadu aplikací, některé vystačí se sadou pouhých tří primerů.

Analýza heteroduplexů se používá k detekci mutací genetických onemocnění stále častěji. Metoda je jednoduchá a citlivá. Principem metody je skutečnost, že heteroduplexy, které se tvoří po amplifikaci u heterozygotů, migrují v agarosovém gelu pomaleji než homoduplexy. Když amplifikované fragmenty ze dvou odlišných alel (mutace, polymorfismus) spolu hybridizují, vytvářejí dva homoduplexy a dva typy heteroduplexů. Za vhodných hybridizačních podmínek vznikají všechny čtyři druhy duplexů v ekvimolárním poměru. Detekce separovaných fragmentů v gelu se provádí barvením ethidiumbromidem nebo stříbrem. V některých případech se využívá tzv. generátoru heteroduplexů, tj. molekuly DNA upravené mutagenesou.

Asymetrická PCR je modifikace PCR, která umožňuje preferenční syntézu jenom jednoho vlákna z duplexu DNA tím, že jeden z primerů je v nadbytku. Jako produkt PCR tak vzniká jednovláknová DNA vhodná např. pro sekvenování. Jinou modifikací je SSPR (single strand producing reaction), která je ještě specifičtější. Tato metoda se také vhodně kombinuje s „nested“ PCR.

Multiplexová reakce je velmi výkonná metoda PCR k testování mnoha delecí a bodových mutací v jedné amplifikační reakci, v jednom elektrofo- retickém dělení v agarose a obvykle s detekcí značením ethidiumbromidem. Nejsložitější je fáze přípravná, kdy je nutno vypracovat takové reakční pod- mínky (sekvence nukleotidů, koncentrace primerů, optimální teploty jednotlivých kroků cyklu atd.), aby amplifikační reakce pro každý testovaný úsek genomické DNA neprobíhala pouze v případě, že se jedná o mutaci v tom kterém příslušném místě. Pro každou reakci je zařazena pozitivní a negativní kontrola. Například v DNA diagnostice delecí v oblasti genu pro dystrofin multiplexová reakce pro oblast 3’ konce testuje 11 různých exonů a pro oblast 5’ konce 7 exonů najednou. Prakticky to znamená, že místo dříve prováděných 18 samostaných amplifikací, se provedou reakce pouze dvě (Abbs et al., 1991).

Pro přímou detekci známých bodových mutací je vhodná metoda hybridizace s ASO (s alelově specifickými oligonukleotidy). Produkty polymerázové řetězové reakce se rozdělí elektroforeticky např. v 1% agarosovém gelu. Pak následuje denaturace a dvojité blotování z gelu, který je umístěn mezi dvě nylonové membrány. Denaturační roztok slouží jako přenosový pufr. Fixace DNA k membránám se provede v UV světle expozicí 1 minutu na transiluminátoru. Následuje hybridizace s alelově specifickými oligonukleotidy (normální a mutantní), které jsou označeny vhodným detekčním systémem, například na 5’ konci a32P (ATP) pomocí T4 polynukleotidkinasy. Za určitých hybridizačních podmínek se dosáhne situace, kdy jediný chybný pár bazí mezi sondou a analyzovanou DNA zabrání hybridizaci. Bezchybně komplementární úseky spolu naopak hybridizují výborně. Po hybridizaci se provede vymývání a detekce proužků například autoradiograficky.

CMC (chemical mismatch cleavage) je metoda štěpení heteroduplexů piperidinem v místě mutace - chybně spárovaných bazí, které jsou chemicky modifikované hydroxylaminem a OsO4 . Následuje separace fragmentů, která se obvykle provádí pomocí denaturační PAGE. Jinou příbuznou modifikací je EMC (enzymatic mismatch cleavage).

AS-PCR (alelově specifická PCR). Pro detekci bodových mutací a malých delecí se často používají metody PCR, které využívají tzv. alelově specifické oligonukleotidy jako primery. Tyto metody prodělaly v posledních letech vývoj od hybridizačních technik, přes dot blot analýzu, nested PCR až po metody, které vystačí s detekcí fragmentů v agarosovém gelu s ethidiumbromidem po elektroforetickém dělení. Alelově specifická dot blot hybridizace je časově náročná a vyžaduje hybridizaci s radioaktivně značenou sondou. Využití alelově specifické PCR ukázal poprvé Olerup et al. (1991) na detekci subtypů HLA.

Princip reakce AS-PCR a ARMS

xx

Princip hodnocení AS-PCR a ARMS
(s=společný, n=normální, m=mutantní primer)

Genotyp

Oligonukleotidy

Produkt reakce

homozygot nebo
hemizygot normální

s + n
s + m

ano
ne

heterozygot

s + n
s + m

ano
ano

homozygot nebo
hemizygot mutantní

s + n
s + m

ne
ano

 

 

Amplifikační refrakční mutační systém (ARMS) je metoda detekce jakékoliv mutace v rozsahu záměny jednoho nukleotidu nebo malé delece. Jedná se o variantu AS-PCR (alelově specifické PCR). Metoda je jednoduchá, spolehlivá, neizotopová a jasně rozliší heterozygota ve sledovaném lokusu od homozygotů pro jednu nebo druhou alelu (Ferrie et al., 1992). Systém je založen na pozorování, že DNA/DNA hybridy pospojované „mismatched“ (nedokonalé spárování) na jejich 3’ konci nejsou vhodnými substráty pro působení Taq DNA polymerasy. Toto důležité pozorování bylo využito a byl vyvinut systém diferenciální amplifikace. ARMS test se skládá ze dvou samostatných reakcí, z nichž jedna je specifická pro normální DNA sekvenci a druhá pro sekvenci s mutací. Do jednoduchého ARMS testu musí být zařazena vnitřní PCR kontrola, aby byla jistota, že amplifikační reakce probíhá správně. Také je možné kombinovat několik ARMS reakcí do jednoho multiplexového (několikanásobného) ARMS testu. Pozitivní kontroly není třeba, smísí-li se 4 nebo více testů a jsou-li současně ARMS reakce kombinovány tak, aby musel vždy vzniknout alespoň jeden reakční produkt v obou reakčních mixech. Vlastní polymerázová řetězová reakce probíhá na termocykleru v běžném provedení.

ARMS metoda byla úspěšně aplikována například k detekci mutací v oblasti genu pro cystickou fibrosu. Byla vyvinuta multiplexová varianta, která simultánně analyzuje DNA vzorek pro čtyři nejběžnější mutace CFTR genu. Reakce A identifikuje CFTR geny, které nemají mutaci F508 a G21+1G>T nebo které mají mutaci G551D a G542X, zatímco u reakce B je tomu právě naopak: identifikuje mutantní sekvenci F508 G21+1G>T a normální sekvenci v oblastech G551D a G542X.

PSM (PCR - mediated site directed mutagenesis) je metodou, která umožňuje identifikaci specifických alel umělou změnou sekvence během PCR tak, že dojde k vytvoření nového nebo k zániku původního restrikčního místa pro restrikční endonukleasu. Metoda je založena na nepřesné hybridizaci sondy s genomickou DNA. Sekvence je modifikována tak, že jeden z primerů se v jednom nukleotidu liší a hybridizuje s templátem v blízkosti zkoumané mutace. Amplifikace oblasti s takto uměle vytvořenou mutací vede k inkorporaci záměny nukleotidu do výsledného produktu PCR. Po štěpení příslušným restrikčním enzymem a elektroforetické separaci se identifikují jednotlivé alely. Metoda byla úspěšně aplikována např. v detekci mutací CFTR genu, genu pro LDL receptor, genu pro fenylalaninhydroxylasu. Jako příklad je uveden princip detekce mutace R1443X v tumor supresorovém genu BRCA1. Tato mutace je výsledkem tranzice C->T v 4446. nukleotidu a způsobuje záměnu argininu ve stop kodon. Zavedení restrikčního místa AlfIII do produktu PCR mutantní alely vede ke vzniku fragmentů 180 a 17 bp. Nemutovaná alela se neštěpí a produkt PCR zůstává 197 bp dlouhý.

Příklad zavedení nového restrikčního místa pro AlfIII do produktu PCR:

xx

RACE je metoda rychlé amplifikace cDNA konců pomocí PCR (Innis et al., 1990). Nejprve se syntetizuje cDNA reverzní transkripcí z mRNA. Je to metoda amplifikace cDNA, kdy syntéza probíhá směrem k 5´ nebo 3´ konci. Musí být známa část sekvence některého exonu. Amplifikace 5´ konců vyžaduje purifikaci prvotní cDNA a ukončení řetězce terminální transferasou za vzniku druhého poly(A) konce. Kombinací se pak získá celá plnohodnotná cDNA.

Internetové odkazy
http://www.uct.ac.za/depts/microbiology/pcr.htm

ss
ss
s
s
sss
ss
ssssss
sss
sss

2) Ligázová řetězová reakce (LCR, LAR)

LCR je metoda amplifikace DNA určená k detekci stopových množství DNA o známé sekvenci. LCR je dvoufázová cyklická reakce (Barany, 1991; Wu et al., 1989). V první fázi se za vysoké teploty (95 °C) cílové molekuly dvouvláknové DNA rozvinou na jednovláknové. V druhé fázi (70 °C) se dvě sady (2x2) komplementárních oligonukleotidů přiloží (hybridizují) k cílovým jednovláknovým molekulám a termostabilní ligasou jsou spolu spojeny. Produkty ligázové reakce z jednoho cyklu slouží jako templát (podklad) pro následující reakci cyklu. Používají se Tth DNA ligasa izolovaná z Thermus thermophilus a Pfu DNA ligasa z Pyrococcus furiosus.

LCR je alternativní amplifikační technika, která může mít některé přímé výhody oproti PCR. Při PCR často vznikají nespecifické amplifikační produkty, které znesnadňují interpretaci výsledků. Toto „pozadí“ (amplifikační artefakty) vzniká tím způsobem, že se oligonukleotidové sondy přikládají (hybridizují) k oblastem jak úplné, tak částečné sekvenční homologie s původní templátovou DNA. Rozlišení PCR produktů vyžaduje separaci pomocí elektroforézy, někdy izolaci z gelu a následné určení sekvence amplifikovaných úseků. Naopak molekuly amplifikované pomocí LCR jsou pouze ty, kde se zcela přesně a správně přiložily oligonukleotidové sondy k homologním úsekům templátové DNA. V případě, že se jedna oligonukleotidová sonda pro LCR označí například biotinem kovalentní vazbou a druhá například alkalickou fosfatasou, pak se amplifikace i detekce objevují současně. Elektroforéza nebo sekvenování nejsou nutné. Z těchto důvodů je LCR také vhodnější k automatizaci než PCR a má větší specificitu. Některé metody kombinují PCR s LCR, takže polymerasa a ligasa jsou přítomny v jedné reakci současně.

3) Qß replikasová reakce (Kramer et al., 1992)

RNA bakteriofág Qß využívá RNA polymerasu k replikaci svého genomu. Qß replikasa nepotřebuje oligonukleotidový primer k iniciaci syntézy RNA, ale rozpoznává vysoce organizovanou oblast RNA genomu jako iniciátoru. Jednovláknová molekula RNA je vhodným templátem pro Qß replikasu. To umožňuje in vitro exponenciální vzestup počtu kopií RNA. Denaturace není potřeba k iniciaci další replikační reakce. Enzym Qß replikasa je velmi rychlý a výkonný: jedna molekula templátu je amplifikována na 10 12 kopií za 10 - 15 minut při 37 °C. V praxi je nejprve sonda hybridizací navázána na Qß templát. Po hybridizaci se provede amplifikace. Aplikace metody jsou limitovány požadavkem na absolutní specificitu hybridizace sondy. Jakékoliv hybridizační pozadí vede k snadné amplifikaci jakéhokoliv produktu.

4) 3SR amplifikační reakce (self-sustained sequence replication; Fahy et al., 1991; Gingeras et al., 1990)

3SR reakce využívá kolektivního účinku reverzní transkriptasy (např. z ptačího myeloblastového viru), RNasy H (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerasy. K syntéze cDNA se používá hybridní primer, který obsahuje cílovou specifickou oblast a nehybridizující konec s promotorem pro T7 RNA polymerasu. Výsledná kopie cDNA má na jednom konci tento promotor. RNasa H degraduje RNA v RNA/DNA hybridu. T7 RNA polymerasa syntetizuje podle DNA mnoho kopiií RNA, které jsou následně opět cílem pro reversní transkriptasu, která syntetizuje další cDNA. Všechny reakce probíhají při stejné teplotě. Reakční činidla jsou v koncentracích tak, aby umožnily akumulaci produktu.

K dalším amplifikačním reakcím patří reakce cyklující sondy (cycling probe reaction; Duck et al., 1990) nebo modifikace jako např. transkripční amplifikační reakce (TAS, isothermal transcription-based amplification reaction; Guatelli et al.,1990), NASBA (nucleic acid sequence based amplification).