Brevt.gif (5086 bytes)

Detekce a analýza molekul RNA patří k důležitým molekulárně biologickým postupům. Molekuly mRNA se podílejí pouze 1 - 2% na celkovém množství izolované RNA (převážnou část tvoří rRNA). Adaptace amplifikačních technik umožňují relativně snadnou analýzu mRNA tím, že po reverzní transkripci následuje amplifikace cDNA např. pomocí PCR. RT-PCR je velmi hodnotná metoda k analýze genové exprese, k detekci infekčních agens, k detekci genetických nemocí (eliminují se introny, poskytuje informace o alternativním sestřihu). Mezi používané reversní transkriptasy patří MLV, AMV, Tth. Reversní transkriptasy M-MuLV (z Moloneyho myšího leukemického viru) a AMV (z ptačího myeloblastického viru) jsou schopny syntetizovat cDNA až do 10 kb, zatímco bakteriální termostabilní Tth DNA polymerasa jen do 2 kb. Reversní transkriptasa Tth na rozdíl od dvou předchozích nemá aktivitu RNasy H a vyžaduje navíc Mn +2 kationty v reakci. Optimální reakční teploty se liší: M-MuLV = 37 °C, AMV = 42 °C, Tth = 65 °C. Používají se tři typy primerů: specifické oligonukleotidy pro syntézu vybrané určité mRNA, směs náhodných hexanukleotidů a oligo(dT)12-18 . Schopnost uskutečnit reversní transkripci a PCR v jedné reakci a v jedné zkumavce je jedinečnou výhodou enzymu Tth, protože se podstatně snižuje riziko kontaminace a celá procedura se zjednodušuje.

ss
s
s