Brflp.gif (11350 bytes)

Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleasami na fragmenty. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Je známo velké množství bakteriálních restrikčních endonukleas (asi 1500), které se liší od sebe tím, že rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů - 4, 6, 8 a že štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bazí a podle rozpoznané sekvence. Za daných podmínek vzniká reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí). Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Některé restrikční endonukleasy jsou citlivé na methylaci DNA. V některých případech methylace adeninu a methylace cytosinu inhibují štěpení, v jiných je methylace pro štěpení nezbytná. Odlišení různých DNA se provádí na základě polymorfismu délky štěpných úseků. Tento polymorfismus vzniká na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst. Obecně restrikční endonukleasy, které rozpoznávají kratší sekvenci, štěpí DNA častěji na menší úseky, zatímco restrikční endonukleasy rozpoznávající delší sekvenci štěpí méně často a na delší fragmenty. Při neúplném (parciálním) štěpení DNA vlivem nevhodných reakčních podmínek vznikají delší úseky (například velký obsah bílkovin, nevhodná teplota, nedostatečná doba). Hvězdičkové štěpení (tzv. „star“ aktivita enzymu) je způsobeno nespecifickým štěpením mimo rozpoznávací místa. Vzniká tak mnoho krátkých úseků. Tento analyticky nepříznivý stav může být způsoben například nadbytkem glycerolu v reakci. Proto nelze zvyšovat koncentraci restrikčního enzymu v reakci zvyšováním použitého objemu, ale použitím stejného objemu enzymu ze zásoby o vyšší koncentraci.

Příklady restrikčních endonukleas a jejich specifických restrikčních míst:

MwoI (Methanobacterium wolfei), inkubační teplota = 60 °C:

XX

DdeI (Desulfovibrio desulfuricans), inkubační teplota = 37 °C:

XX

HaeIII (Haemophilus aegyptius), inkubační teplota = 37 °C:

XX

Znalost restrikčních endonukleas citlivých na methylaci (např. enzymy HpaII a EagI štěpí pouze nemethylovanou DNA) má široké uplatnění například v X-inaktivačních studiích pro diagnostiku aktivního a neaktivního chromozomu X u řady onemocnění (např. Wiskottův - Aldrichův syndrom, mukopolysacharidosa typu II). Klinický význam má studium náhodné a nenáhodné inaktivace v různých buněčných populacích. Test se provádí ve dvou reakcích.

Kromě RFLP se pro DNA diagnostiku a pro studium příbuzenských vztahů (například průkaz otcovství) hojně využívá polymorfismu repetitivních úseků DNA - VNTR (variabilní počet tandemových opakování). Tak například pro chromozom X se používá sondy M27 beta (EcoRI, MspI, PstI), pro chromozom 15 sondy CMS620 (HinfI), CMW-1 (TaqI), pro chromozom 7 sondy MS31 (HinfI).

Zatímco při RFLP jsou jednotlivé alely charakterizovány velikostí získaných fragmentů v závislosti na přítomnosti variabilního restrikčního místa, při VNTR jsou jednotlivé alely charakterizovány buď velikostí fragmentu v závislosti na počtu repetic nebo intenzitou (množstvím) při štěpení, které oddělí jednotlivé repetice.

Princip RFLP (Cílová DNA obou chromosomů 1 a 2 je štěpena restrikční endonukleasou v pravidelném restrikčním místě a a variabilním místě á.)

 XX

Obraz na gelu po elektroforetické separaci:

XX

Princip VNTR (Cílová DNA je štěpena podle počtu opakování dané sekvence restrikční endonukleasou v místě a za vniku dvou různě dlouhých fragmentů nebo jinou restrikční endonukleasou v místě b za vzniku odlišné intensity proužku.)

XX

Obraz na gelu po elektroforetické separaci:

XX

 

ss