Bnovm.gif (3955 bytes)

K nově vyvíjeným metodám patří minisekvenování, DNA (genové) chipy, strand displacement amplification, PCR-pouch, NASBA, TaqMan, branched DNA, CFLP (cleavase fragment length polymorphism) a jiné. Nejvíce perspektivní se jeví metody, které integrují do jednoho homogenního systému amplifikaci a detekci s průběžným měřením (např. fluorescence) a vyhodnocováním již během PCR v termocykleru.

Jednou z nových perspektivních technik jsou prostorově adresné oligonukleotidové matice - DNA čipy. Tyto matice jsou připraveny in situ pomocí fotolitografie a chemické syntézy oligonukleotidů na pevném např. skleněném nosiči. Umožňují na principu alelově specifické oligonukleotidové hybridizace opakované a rychlé testování buď prosté přítomnosti nebo sekvenační analýzy fluoresceinem značených nukleových kyselin. Inkubační (hybridizační) fázi může podle potřeby předcházet amplifikace testované cílové DNA pomocí PCR. Hustota oligonukleotidové matice a její informační kapacita je limitována prostorovým rozlišením v jakém mohou být jednotlivé oligonukleotidové sekvence na čipu imobilizovány, syntetizovány a hlavně nakonec detekovány po hybridizaci. Tak vysoce prostorově citlivé detekce intenzity emitované fluorescence bylo dosaženo speciálním laserovým scannerem (epifluorescence confocal scanning microscopy). V současnosti dosahované rozlišení 20 mm umožňuje umístění 400 000 různých oligonukleotidových sekvencí na plochu 1.6384 cm2 . Toto rozlišení je dostačující např. k úplnému sekvenování 16 kb mitochondriálního genomu.

Metoda využívající bDNA je amplifikační metodou zvláštní v tom, že po reakci s cílovou detekovanou DNA (RNA) probíhá amplifikace signálu a nikoliv templátu. Amplifikace se docílí použitím syntetických větvených oligonukleotidů. Tato metoda se používá např. k detekci a kvantifikaci virové RNA nebo DNA. Systém využívá alkalickou fosfatasu a substrát pro chemiluminiscenci (dioxetan). Signál je přímo úměrný množství kopií (molekul) detekované nukleové kyseliny (počet kopií/ml) a měří se na luminometru.

Samostatnou pozornost si zaslouží ještě další separační a detekční systém - MS (hmotnostní spektrometrie). Zavedení šetrných ionizačních technik, např. elektrosprej nebo MALDI (matrix assisted laser desorption ionization), umožnilo aplikovat MS k analýze větších biomolekul (DNA). Jako nová metoda k detekci mutací byla nedávno popsána kombinace PROBE (primer oligo base extension) s MALDI-TOF(time of flight) -MS (Braun, A. et al., 1997). PROBE je metoda podobná minisekvenování.